近年來(lái)，隨著生物制劑復(fù)雜性的增加，內(nèi)毒素低回收率（Low Endotoxin Recovery,LER）現(xiàn)象對(duì)藥品安全檢測(cè)體系的挑戰(zhàn)愈發(fā)凸顯。FDA已強(qiáng)制要求制藥企業(yè)在提交生物制品上市申請(qǐng)（BLA）時(shí)，必須提供研究數(shù)據(jù)證明鱟試劑法（USP<85>）在特定時(shí)間段內(nèi)從加標(biāo)樣品中回收內(nèi)毒素的能力。這一舉措直指LER現(xiàn)象的核心矛盾——當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化鱟試劑（LAL）檢測(cè)因基質(zhì)干擾無(wú)法準(zhǔn)確回收內(nèi)毒素時(shí)，如何確保藥品的安全性未被系統(tǒng)性低估？

一、內(nèi)毒素低回收率現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與定義

內(nèi)毒素低回收率是指在藥品或制劑中，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化鱟試劑（LAL）檢測(cè)時(shí)，內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）的回收率顯著低于預(yù)期的現(xiàn)象。該現(xiàn)象最早在含螯合緩沖液及聚山梨酸酯類(lèi)輔料的單克隆抗體藥物研究中被發(fā)現(xiàn)：當(dāng)LAL試劑與特定基質(zhì)接觸后，其對(duì)CSE的反應(yīng)性呈現(xiàn)溫度依賴性、瞬時(shí)且可重復(fù)的下降。

需注意的是，“內(nèi)毒素"與“CSE"存在本質(zhì)區(qū)別：內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外膜的天然混合物，以囊泡形式存在；而CSE是通過(guò)人工純化的脂多糖（LPS），通常添加穩(wěn)定劑和賦形劑以延長(zhǎng)保質(zhì)期。藥典內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）和市售CSE主要用于校準(zhǔn)、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及藥典適用性研究。

二、LER的潛在機(jī)制：多因素綜合作用

盡管LER的確切機(jī)制尚未完-全明確，但研究提出了多因素綜合作用的假說(shuō)：

1、電荷屏蔽效應(yīng)

LPS在pH＞2時(shí)帶負(fù)電荷，可能與CSE和陽(yáng)離子蛋白質(zhì)結(jié)合，“掩蓋"LPS的作用，降低其可檢測(cè)性。

2、螯合劑影響

LAL試劑需要二價(jià)陽(yáng)離子進(jìn)行反應(yīng)，螯合劑可能封存這些陽(yáng)離子，降低試劑活性。然而，研究表明添加Mg2+對(duì)恢復(fù)LER中的活動(dòng)作用有限。

3、表面活性劑誘導(dǎo)的構(gòu)象改變

聚山梨醇脫氧膽酸鈉（Doc）和十二烷基*（SLS）等分散劑可使LPS膠束解離成更小的復(fù)合物或單體，降低其生物活性。有趣的是，這些膠束可能在去除洗滌劑后重新形成，恢復(fù)活性。

4、多因素綜合作用

最終LER機(jī)制可能是螯合劑類(lèi)型和濃度、聚山梨酯類(lèi)型和濃度以及蛋白質(zhì)離子性質(zhì)等多種因素共同作用的結(jié)果。

三、LER與檢測(cè)干擾的關(guān)聯(lián)性

LER屬于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET）中的抑制性干擾，需通過(guò)適用性測(cè)試排除。USP<85>要求將樣品稀釋至無(wú)干擾狀態(tài)以定量回收CSE活性，但未強(qiáng)制要求未稀釋產(chǎn)品的回收率達(dá)標(biāo)。

實(shí)際研究表明，即使通過(guò)適用性測(cè)試，含LER基質(zhì)的產(chǎn)品仍可能無(wú)法從原液中定量回收CSE。FDA研究進(jìn)一步證實(shí)，LER現(xiàn)象廣泛存在于含螯合劑或表面活性劑的制劑中，且在加速穩(wěn)定性研究中，CSE加標(biāo)后的回收率隨時(shí)間推移呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。

四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的四重防線

實(shí)驗(yàn)室可以制備內(nèi)毒素，但沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)方法，分析人員需保持方法清晰一致。

1、明確規(guī)定測(cè)試參數(shù)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：因?yàn)?/span>LAL試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y-截距變異可能放大LER效應(yīng)。

2、加標(biāo)量需實(shí)測(cè)而非假設(shè)：例如標(biāo)稱5EU/mL但實(shí)際僅1EU時(shí)，簡(jiǎn)單計(jì)算可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。

3、時(shí)效性管理：LER效應(yīng)具有時(shí)效性，動(dòng)物試驗(yàn)與體外檢測(cè)（如BET）需嚴(yán)格同步操作，避免因時(shí)間差導(dǎo)致結(jié)果偏差。

4、方法學(xué)選擇：考慮不同檢測(cè)方法（如LAL、配體、單核細(xì)胞活化試驗(yàn)）間的差異。實(shí)驗(yàn)室自制內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)化是另一難點(diǎn)?，F(xiàn)行指南要求其活性需與RSE/CSE在動(dòng)力學(xué)參數(shù)（起始時(shí)間、反應(yīng)斜率等）上一致，但凍干制劑與溶液態(tài)內(nèi)毒素的效價(jià)定義差異（EU/ng和EU/mL）增加了比對(duì)難度。

*活性與效價(jià)的區(qū)別：活性以濃度表示，通常為EU/mL，或在RSE的情況下為EU/瓶。購(gòu)買(mǎi)的CSE以凍干制劑形式提供，按重量填充，通常為ng/vial。

效價(jià)定義為CSE的特定活性，即活性/單位重量，通常為EU/ng，效價(jià)測(cè)定是將重構(gòu)CSE的重量單位（ng/mL）與重構(gòu)RSE的活性單位（EU/mL）關(guān)聯(lián)，得出以EU/ng為單位的CSE效力的方法。

五、LER對(duì)藥品安全性評(píng)估的影響

盡管FDA數(shù)據(jù)顯示，2004-2015年間僅5次生物制品召回涉及實(shí)際安全問(wèn)題，且均與LER無(wú)關(guān)，但監(jiān)管層仍強(qiáng)調(diào)需優(yōu)先采用與RSE/CSE特性匹配的實(shí)驗(yàn)室自制內(nèi)毒素進(jìn)行方法驗(yàn)證。這一策略的邏輯在于：若LER源于CSE與天然內(nèi)毒素的差異，則通過(guò)匹配二者理化特性的加標(biāo)物，可最大限度模擬真實(shí)污染場(chǎng)景，從而避免假陰性風(fēng)險(xiǎn)。

六、結(jié)論

LER現(xiàn)象揭示了標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)毒素（CSE）與天然內(nèi)毒素在理化性質(zhì)及基質(zhì)相互作用上的本質(zhì)差異，盡管其可能導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果被低估，但現(xiàn)有證據(jù)表明并不直接威脅藥品安全性，制藥行業(yè)需在確保檢測(cè)科學(xué)性的前提下，持續(xù)探索機(jī)制并優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，以平衡LER風(fēng)險(xiǎn)與檢測(cè)效率，鞏固鱟試劑法（LAL試驗(yàn)）作為內(nèi)毒素質(zhì)量控制核心檢測(cè)工具的地位